16S/18S/ITS扩增子测序

技术介绍

16S rDNA 扩增子测序：16S rDNA 为原核生物中编码核糖体小亚基 rRNA 的 DNA 序列，具有 9 个高变区域（V1-V9）和 10 个保守区域，其中保守区反映细菌种属间亲缘关系，高变区反映了物种间的特异性，选择通用引物进行 PCR 扩增，进而通过新一代测序技术对 16S rDNA 的单个或多个高变区进行测序，来分析环境或者临床样本中古菌或细菌的群落结构多样性。18S rDNA 扩增子测序：18S rDNA 真核生物中编码核糖体小亚基 rRNA 的 DNA 序列，具有可变区（V1-V9，没有 V6 区）和保守区。保守区反映生物物种间的亲缘关系，高变区反映物种间的差异。选择通用引物进行 PCR 扩增，进而通过新一代测序技术对 18S rDNA 的高变区（一般选择 V4 区）进行测序，来分析环境或者临床样本中真核生物群落结构多样性。ITS 扩增子测序：ITS 分为两个区域：ITS1/ITS2，其中 ITS1 位于真核生物核糖体 rDNA 序列 18S 和 5.8S 之间，ITS2 位于真核生物核糖体 rDNA 序列 5.8S 和 28S 之间。通过新一代测序技术对 ITS1 或者 ITS2 进行测序，进一步做环境微生物中真菌多样性分析。

方案策略

样本要求

环境及临床样本（干冰或冰袋运送）

土壤≥ 3 g（污染土壤样本要适当增加送样量）；粪便≥ 2 g；

水体样本：滤膜（0.22 μm 滤膜）≥ 2 个；拭子样本≥ 2 个；

DNA/PCR 产物（干冰或冰袋运送）

DNA：浓度≥ 20 ng/μL；总量≥ 400 ng；DNA 要有明显主带，无降解；OD260/280= 1.8-2.0

PCR 产物：浓度≥ 20 ng/μL，总量≥ 400 ng，片段大小 <450 bp，条带单一，无降解，无引物二聚体

实验流程

数据分析