同济大学 PNAS 开发治疗肝细胞癌 HCC 的新型联合疗法

　　全球每年有近 60 万人因肝癌死亡，在所有癌症的死亡人数中排名第二 (1);而由于乙肝流行等因素，中国成为世界范围内的肝癌高发地区，肝癌发病率约为欧美国家的 4 倍。在所有不同类型肝癌中，肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)最为常见。由于缺少有效的分子靶向治疗手段，HCC 的致死率依然居高不下，5 年生存率仅为 10%(2)。因此，深入阐述 HCC 发生发展的分子机制，并基于此寻找新的更高效安全的分子靶点以治疗 HCC 迫在眉睫。

　　DNA 双链断裂(DNA double strand breaks, DSBs)是对机体危害最大的 DNA 损伤类型，这种损伤由独立且互相竞争的同源重组 (Homologous recombination, HR)和非同源末端连接(Nonhomologous end joining, NHEJ)来修复，以维持基因组的稳定性。DNA 修复能力下降引发的基因组不稳定现象是包括肝癌在内的多种肿瘤发生的重要诱因 (3);而另一方面，肿瘤细胞却需要激活自身 DNA 修复通路用于修复高复制压力和氧化压力导致的大量 DNA 损伤 (4, 5)。但是，由于相关动物模型的缺乏，科学家们尚无法判断体内环境下包括 HCC 在内的多种肿瘤发生与发展过程中 DSB 修复能力的变化情况，因此也很难评估是否可通过靶向 DNA 损伤修复以治疗 HCC 及其它类型肿瘤。

　　10 月 5 日，同济大学生命科学与技术学院毛志勇团队和孙方霖团队联合在 Proceedings of the National Academy of Sciences 上在线发表了题为 Rational combination therapy for hepatocellular carcinoma with PARP1 and DNA-PK inhibitors 的工作，该研究工作首次利用小鼠报告模型在体内比较了 HCC 和癌旁组织的 DSB 修复能力，发现：HCC 中 HR 和 NHEJ 修复效率均显著上调，而 PARP1 和 DNA-PKcs 是介导该变化的关键基因。进一步的研究提示：同时靶向抑制 PARP1 和 DNA-PKcs 酶活显著抑制了小鼠原位 HCC 和人 HCC 的 PDX 模型的增殖，提示其具有重要的潜在临床应用价值。

　　研究团队将基于绿色荧光蛋白 GFP 建立的检测 HR 的报告载体整合到小鼠基因组 Rosa26 位点, 建立了体内检测 HR 效率的报告小鼠模型，同时结合 Gorbunova 教授课题组赠予的 NHEJ 报告小鼠模型 (6)，通过尾静脉注射将外源 I-SceI 质粒导入小鼠肝脏，从而诱导报告载体发生定点的 DSB。若细胞成功通过 HR 或者 NHEJ 修复该损伤，细胞会发出绿色荧光，因此可以定量分析组织中 HR 或 NHEJ 修复的频率。在 DEN/CCl4 / 乙醇诱导的小鼠 HCC 模型中检测发现，相比于癌旁组织，HR 和 NHEJ 在癌组织中分别提升了 1.6 和 2.5 倍。

　　为探究 HR 和 NHEJ 在癌组织中提升的原因，研究团队检测了小鼠癌组织及癌旁组织中 DSB 修复通路中各蛋白的表达情况，发现：关键修复因子 PARP1 和 DNA-PKcs 的表达显著提升。而团队成员利用大量临床标本进一步验证发现：上述两种蛋白在人类 HCC 中依然呈现明显的表达上调，暗示其在 DSB 修复的激活和肝细胞癌发展维持中扮演了重要角色。进一步研究显示：利用 PARP1 抑制剂 olaparib 和 DNA-PKcs 抑制剂 NU7441 同时处理 HCC 细胞可以极大地抑制其 HR 和 NHEJ 修复能力。更为重要的是，联合应用 olaparib 和 NU7441，或同时敲降 PARP1 和 DNA-PKcs 都可协同抑制 HCC 细胞的增殖，证明二者可作为治疗 HCC 的潜在靶标。后续的机制研究发现，olaparib 可通过抑制 PARP1 酶活，从而阻碍 ALC1 在损伤位点的募集，继而延缓损伤位点周围核小体的清除，最终抑制 RPA2 和 RAD51 在损伤位点的招募。最后，研究团队基于小鼠原位 HCC 和人 HCC PDX 模型，进一步证实了 olaparib 和 NU7441 联用通过靶向 DSB 修复以治疗 HCC 的巨大潜力。综上所述，该研究团队建立了体内检测肝细胞 DSB 修复效率的新方法。本项研究中建立的小鼠模型有助于肿瘤、衰老以及其它研究领域深入探索体内环境下 DSB 变化及其调控机制。此外，该工作发现了导致 HCC 中 DSB 能力提升的关键基因 PARP1 和 DNA-PKcs，并阐明了 HCC 中 PARP1 调控 HR 的机制。本项研究中 olaparib 和 NU7441 联合疗法的成功临床前应用提示：靶向 DSB 修复在 HCC 治疗中具有潜在的临床应用价值。此外，该研究亦拓宽了 PARP1 抑制剂在肿瘤治疗中的应用，也为 HCC 的后续治疗提供了重要的理论基础。

　　同济大学生命科学与技术学院博士后王晨博士、博士研究生唐欢胤、附属第一妇婴保健院助理研究员耿安珂博士、东方肝胆外科医院戴炳华医生为本文的共同第一作者。同济大学生命科学与技术学院毛志勇教授、孙方霖教授和蒋颖副教授为本文的共同通讯作者。此外，毛志勇教授课题组的多名老师和同学，高绍荣教授课题组的多名老师和同学，同济大学附属第一妇婴保健院万小平教授、贺其志主任，浙江大学药学院朱虹教授，东方肝胆外科医院杨甲梅教授及中南大学附属湘雅医学院谭嵘博士课题组多名成员均参与了该项工作。该研究成果得到国家重点研发计划、国家自然科学基金、上海市优秀学术带头人计划、上海市教委与上海市教育发展基金会 “曙光” 计划等项目资助。

　　原文链接：https://www.pnas.org/content/early/2020/10/02/2002917117